Le blé tendre, (Triticum aestivum), le blé dur (Triticum turgidum ssp. durum) ainsi que les espèces sauvages qui leur sont apparentées, appartiennent à la tribu des Triticées. Les génomes de ces espèces sont constitués d'un nombre de chromosomes multiple de 7, et dérivent probablement d'un ancêtre commun. Ces génomes, dits 'homéologues', présentent de grandes similitudes, mais aussi des différences qui pourraient être partiellement responsables de l'hérédité strictement diploïde des espèces allo-polyploïdes. Les processus évolutifs qui ont conduit à la différenciation de ces génomes sont encore peu connus. Explorer la structure physique et moléculaire de ces génomes homéologues permettra de comprendre leur organisation ainsi que les processus évolutifs qui ont conduit à leur différenciation.

Les travaux ont été focalisés sur plusieurs familles de protéines impliquées dans la qualité technologique des blés (i) des protéines ayant une forte affinité pour les lipides (protéines de transfert de lipides ou LTP et puroindolines) qui joueraient un rôle en panification, (ii) des protéines impliquées dans la friabilité du grain (puroindolines), (iii) des oxydoréductases modifiant les propriétés viscoélastiques des pâtes via le changement de l'état rédox des ponts disulfures des protéines de réserve (thiorédoxine, thiorédoxine réductase ou NTR, glutathion réductase ou GR) ou la couleur (peroxydases et polyphénoloxydases).

Protéines de transfert de lipides (LTP)

La production de LTP recombinante a d’abord été conduite dans E. coli. et l’étude de quatre mutants a mis en évidence le rôle de la tyrosine 79 dans la fixation des lipides (Lullien-Pellerin et al., 1999). Pour pallier la formation de corps d’inclusion, le système Picha pastoris a été utilisé avec succès pour la production de grandes quantités (g/l) d’une LTP de 9 kDa soluble, correctement repliée et active (Klein et al., 1998). La technique de chromatographie en lit fluidisé a été utilisée pour purifier la protéine en une seule étape (de Lamotte et al. 1999).

La production dans P. pastoris d’une LTP de 7 kDa marquéee à l’azote 15 a permis de suivre, au cours de la fermentation, l’accumulation et le repliement de la protéine par RMN (HSQC ¹⁵N = Heteronuclear Single Quantum Correlation) (de Lamotte et al., 2001a). La détermination par RMN de la structure tertiaire est terminée (publication en cours de rédaction) et une étude dynamique de la protéine liée à différents lipides a été réalisée (de Lamotte et al., 2001b). Une étude comparative des structures des LTP de 7 et 9 kDa de blé, par modélisation, est en cours.

L’isolement de clones d'ADNc codant des LTP de 7 et 9 kDa indique qu’au minimum 10 gènes ltp sont exprimés dans le grain de blé en développement. Une analyse par RT-PCR a montré que chacun de ces gènes à un profil d’expression différent. La structure des gènes ltp est également différente, certains gènes possédant un intron dont la taille est variable. L’isolement des promoteurs des gènes correspondant à ces ADNc est en cours (Thèse Freddy Boutrot).

Puroindolines

Les puroindolines recombinantes produites dans P. pastoris, du fait de leurs fortes affinités pour les lipides polaires, restent fortement attachées aux membranes ce qui rend leur sécrétion et purification difficiles (Issaly et al., 2001). Le système P. pastoris a été abandonné et les puroindolines sont actuellement produites dans E. coli. Le gène rapporteur gus sous contrôle du promoteur du gène de la puroindoline-b s’exprime uniquement dans le grain de riz et spécifiquement dans l’albumen, la couche à aleurone, l’épiderme et le scutellum de l’épithélium (Digeon et al., 1999). Le promoteur du gène de la puroindoline-a est en cours d’étude dans des riz transgéniques (Thèse Alexandre Evrard).

Les gènes de puroindolines ont été perdus durant la spéciation des blés puis restaurés dans Triticum aestivum par hybridation de T. turgidum avec T. tauschii. Des séquences codant des protéines de type puroindolines sont présentes dans les céréales proches du blé (orge, avoine, seigle) et absentes de céréales plus éloignées (maïs, riz, sorgho) [Gautier et al., 2000].

En collaboration avec un industriel (Biogemma, UK), des blés tendres transgéniques surexprimant les puroindolines ont été obtenus et un brevet a été déposé. Des blés durs transgéniques sont réalisés en collaboration avec P. Shewry (Bristol, UK).

Systèmes d’oxydoréduction du grain de blé 

Protéines du système thiorédoxine NADP-dépendant

L’existence d’au moins 5 isoformes de thiorédoxine h et de 2 isoformes de thiorédoxine réductase dans le grain de blé rend cette étude complexe. Un protocole de purification de cinq isoformes de thiorédoxine h du grain de blé a été mis au point. Nous avons entrepris des travaux afin de mieux appréhender la variabilité des thiorédoxines cytosoliques et de clarifier le rôle de chacune d'elles.

Les protéines spécifiquement ciblées par les différents systèmes ont été identifiées. La thiorédoxine est capable de réduire toutes les familles protéiques et s'est révélée être un réducteur spécifique des gluténines de hauts poids moléculaires, ces protéines n'étaient pas réduites par les autres systèmes. Le glutathion réduit sélectivement certaines gliadines et gluténines de faibles poids moléculaires. Il semble former des complexes (" mixtes glutathions ") avec certaines de ces protéines de faibles poids moléculaires. Dans des conditions favorables, les protéines réduites à la suite de l'action des systèmes réducteurs peuvent se réoxydent en formant des nouveaux ponts disulfures. Les résultats montrent que la plupart des protéines réduites seraient capables de participer à la formation de réseaux macromoléculaires par réoxydation des résidus cystéines (Thèse Fabrice Jarraud)..

Une thiorédoxine h de blé tendre a été produite dans E. coli sous forme soluble et active, capable de réduire certaines des protéines cibles du blé (Gautier et al., 1998). En collaboration avec le Centre de Biologie Structurale (CBS), 30% des systèmes de spins de la protéine recombinante ont pu être attribués. Pour terminer cette structure il est nécessaire de disposer d’une protéine marquée qui sera produite dans P. pastoris , le clonage, les conditions de fermentation et de purification ont été mis au point.

Un gène codant une thiorédoxine h de blé tendre a été isolé et son promoteur étudié dans des riz transgéniques. Le gène gus sous contrôle du promoteur du gène TaTrxh2 s’exprime spécifiquement dans les cellules de l'albumen amylacé du grain de riz [Ihorai, 1998]. Un brevet a été déposé sur ce promoteur [Gautier et al., 1999]. Les ADNc et gènes codant les autres isoformes de thiorédoxine et de thiorédoxine réductase sont en cours afin d’étudier leur structure et régulation.

Le système thiorédoxine NADP-dépendant permet la neutralisation d'allergènes alimentaires (brevet Buchanan et al., 1999).

Système glutathion réductase (GR)

Trois isoformes de GR ont été identifiées dans le grain de blé et la forme majoritaire a été purifiée et caractérisée (de Lamotte et al., 2000). La variabilité de la GR dans le genre Triticum ainsi que sa répartition dans les différents parties du grain ont été suivies à l’aide d’un anticorps spécifique.

L’étude de l'impact du système GR en technologie à mis en évidence l'absence de corrélation positive entre l’activité GR et l’indice de jaune des pâtes alimentaires.

L'effet spécifique du glutathion réduit par la GR sur les protéines du blé a également été étudié.

Peroxydases (PO) et polyphénoloxydases (PPO)

Le brunissement des pâtes alimentaires serait en bonne partie due à l'activité des PO. L'une des isoformes majeures (P-5) serait plus particulièrement impliquée. L'isolement et la caractérisation des deux isoformes (P-5 et P-6) ont été réalisés et l'hérédité des peroxydases majeures a été déterminée ainsi que leur localisation histologique in situ, en utilisant deux techniques complémentaires, la détection immunochimique et la détection de l'activité (Fraignier et al., 2000). Le rôle de la PPO du blé dur dans le brunissement des pâtes alimentaires, même s'il ne doit pas être complètement écarté, peut être considéré comme mineur, l'amande du blé ne contenant pas de PPO typique.

Rôle de protéases fongiques sur les protéines des céréales

Il a été montré que certaines protéases fongiques ont une très grande spécificité d’action vis-à-vis des protéines de céréales et plus particulièrement de celles du blé (gliadines et gluténines). Les résultats obtenus suggèrent la possibilité d'améliorer la qualité de certains aliments, et d'obtenir de nouveau produits par l'utilisation de gluten spécifiquement modifié.

Gènes induits par la dessiccation et la maturation de la graine.

La caractérisation de plusieurs gènes induits par la dessiccation [Bourgeois, 1998] a conduit à mettre en évidence un rôle protecteur de certaines protéines codées par ces gènes notamment pour la cryoprotection des levures. Ces résultats ont conduit au dépôt d’un brevet [Bourgeois et al., 2000].

Dans le cadre du programme ITMI/ITEC, 1500 EST (sur 3300 produites) issues de la banque d’ADNc construite à partir de racines de jeunes plantules de blé dur stressées (stress hydrique) ont été mises à disposition de la communauté scientifique.

Des membranes correspondant à ces 3300 EST seront hybridées avec des sondes correspondant à du matériel ayant subi différents types de stress abiotiques (dessiccation, froid, salin). L'accumulation des transcrits des gènes induits lors de la phase de dessiccation du grain et dans les organes végétatifs de jeunes plantules stressées (dessiccation, froid, sels) est actuellement suivie par RT-PCR quantitative (Thèse Ali Benali).

Production d’EST de gènes exprimés au cours du développement du grain.

Dans le cadre du programme Génoplante (phase I) 12 banques d’ADNc ont été réalisées à partir de grains prélevés tous les 50°C.jour depuis l’anthèse jusqu’au grain mûr et 2 autres à partir de feuilles. 100 000 EST de blé correspondant principalement à des gènes exprimés au cours du développement du grain ont été obtenues. La bioanalyse de l’ensemble de ces données est en cours (Génoplante Info) pour permettre la réalisation de membranes pour l’analyse du transcriptome qui fait l’objet de la phase II de Génoplante. Une DNA chip en cours de réalisation regroupant un " set unigène " et des membranes thématiques (qualité, réserves –amidon, lipides, sucres-, facteurs de transcription, maladies…).seront analysées en différentes conditions (développement, conditions agroclimatiques). Les gènes et les ADNc pleine longueur les plus pertinents seront alors recherchés en vue d’études de fonctionnalité (transgénèse : programme Génoplante CP1P8).

Autres thèmes abordés

Identification de gènes impliqués dans des maladies fongiques (programme GénoplanteCP4P2)

Pour identifier des ADNc correspondant à des gènes spécifiquement ou différentiellement exprimés lors de l’infection de l’épi de blé par Fusarium culmorum, trois approches ont été développées. (i) Par hybridation soustractive suppressive (SSH), 94 clones non régulés mais correspondant à des gènes fortement exprimés et donc susceptibles de coder pour des protéines de défense ont été isolés. (ii) Par AFLP cDNA, 24 candidats ont été clonés. (iii) Une banque d’ADNc a été construite à partir d’ARNm extraits de glumes d’épis infectés et 72 000 clones ont été repiqués sur membranes. Le criblage différentiel de ces membranes est en cours et 3000 clones seront ensuite séquencés.

Détection et quantification de transgènes dans des produits issus d’Organismes Génétiquement Modifiés

Participation à plusieurs programmes de développement et/ou de normalisation (programme AFNOR) de méthodes de détection et de quantification de transgènes dans des produits à base de maïs et/ou de soja. Nous faisons partie du réseau français de laboratoires publics impliqués dans la mise au point des méthodes de détection (4 autres laboratoires) et d’un réseau européen (Ring Test d'Ispra) auquel participent 29 laboratoires de 13 pays.

Pour répondre aux nouvelles réglementations européennes (49/200 et 50/2000) qui font intervenir des concentrations seuils de 1% d’ingrédients issus d’OGM, nous avons développé une technique de quantification des transgènes dans les OGM et produits à base d’OGM en utilisant la PCR en temps réel (ABI Prism 7700 Taqman) (Alary et al., 2001).

Participation à un programme ACTIA dont les objectifs sont de définir des protocoles de détection voire de quantification de transgènes dans des produits transformés (type conserve), préparés dans des conditions contrôlées.

Cette thématique, ne sera pas poursuivie au delà de la fin des programmes en cours (courant 2002).

Evolution des génomes du blé avec la polyploïdie

Un clone BAC unique (de 96 kb) de Triticum monoccocum a été identifié, contenant les trois gènes codant respectivement pour les puroindolines -a, et -b et pour la GSP. La séquence quasi-entière de ce clone BAC a été obtenue par N.Chantret , dans le laboratoire de J.Dubcovsky, en collaboration avec O.Anderson (USDA Albany). La séquence est maintenant en cours de ‘finishing’ et d’annotation (cf figure ci-contre).

Une banque BAC de blé dur (tétraploïde de génome AABB, cultivar Langdon) a été réalisée dans le laboratoire de J.Dubcovsky par A.Cenci (Université de Bari, Italie) et N.Chantret. Cette banque contient 516.096 clones, de taille moyenne estimée à 131 kb. Une copie de cette banque, ainsi qu’un jeu de filtres, ont été achetés par l’Inra et sont maintenant disponibles au sein de l’UMR. Cinq clones BAC comportant la GSP ont été identifiés, assemblés en un contig estimé à plus de 150 kb et assignés au génome A ou B. Ils serviront de base pour comparer les séquences.

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