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Analyse fonctionnelle
du génome du riz : création d’une collection de mutants
d’insertion de riz
Partenaires
- INRA/ENSAM/Université Montpellier 2, 34 Montpellier
- CNRS/Université de Perpignan, Génome et développement
des plantes,
UMR 5096, 66860 Perpignan
- CIRAD/AMIS, programme Biotrop, UMR 1096 TA, 34 Montpellier
- IRD, Genetrop, 34 Montpellier
Coordinateur du projet
Michel Delseny
Contexte et objectifs du projet
Du fait du lancement du séquençage public
du génome du riz, première céréale de consommation
humaine, génome qui concentre et conserve remarquablement l’ordre,
la nature et de la fonction de l’ensemble des gènes des génomes
des autres grandes céréales (blé, maïs, orge,
sorgho), il a été pressenti dès l’initiation
du programme GÉNOPLANTE l’importance de disposer d’un
outil global pour analyser la fonction des gènes des céréales.
Cette approche de découverte et de validation de la fonction des
gènes à l’échelle du génome peut être
obtenue, à l’instar de ce qui a été réalisé
chez Arabidopsis thaliana ces dix dernières années, par
la constitution d’une collection de lignées de riz qui contiennent
un élément insertionnel (ADNT ou élément transposable
introduit ou endogène) dans la plupart des gènes, qui en
interrompt la séquence et donc la fonction ce qui peut produire
un effet visible sur le phénotype.
L’objectif du projet était de débuter
la création d’une collection de 50 000 lignées d’insertion
de riz contenant des inserts ADN-T, introduits par transformation via
Agrobacterium tumefaciens et de nouvelles copies du rétrotransposon
endogène Tos17 amplifiées au cours des phases de culture
de tissus. L’objectif était également de caractériser
la majorité des lignées pour la séquence du site
d’insertion de l’ADN-T, permettant ensuite une identification
directe d’une lignée affectée dans une séquence
d’intérêt. Cette première phase du projet visait
également à la mise en place des infrastructures nécessaires
à la production et à la caractérisation moléculaire
des lignées et l’adaptation des méthodes à une
production à haut débit de lignées et de récupération
et séquençage des régions adjacentes au sites d’intégration
des inserts.
Méthodologie
La méthodologie fait appel à une procédure
hautement efficace de production de transformants primaires par co-culture
de cals dérivant de l’embryon du grain de la variété
Nipponbare avec la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Lors de
cette procédure, un ADNT contenant le gène rapporteur gusA
-pouvant être activé lorsque il s’insère dans
ou à proximité d’un gène et donc le détecter-
est introduit au hasard dans le génome du riz. L’ADN des jeunes
plantes régénérées est isolé et la
région génomique adjacente au site d’insertion de l’insert
ADN-T, amplifiée puis séquencée. Cette séquence
permet un positionnement de l’insertion sur les chromosomes du riz
par recherche d’homologies et également d’effectuer une
première recherche pour savoir quel gène a été
interrompu. Les transformants primaires sont portés à graine
et récoltés. Les descendances peuvent ensuite être
utilisées directement ou après multiplication, pour identifier
des changements dans différents caractères et les gènes
affectés qui leurs sont associés.
Présentation des résultats
Une phase exploratoire a tout d’abord été
conduite de juillet 1999 à juin 2000 : celle ci visait à
évaluer le potentiel des trois éléments insertionnels
pouvant être utilisés sur le riz , ADN-T, rétrotransposon
endogène Tos17 ou système de transposons Ac/Ds, en analysant
du matériel produit antérieurement au laboratoire dans le
cadre d’autres projets. Cette évaluation a conclu à
l’efficacité dans notre laboratoire de la production de mutants
par Agrobacterium tumefaciens qui en plus entraînait une amplification
modérée du rétrotransposon Tos17. Parallèlement,
a été installée une méthode d’isolement
des régions flanquantes des inserts ADN-T et Tos17 basée
sur la walk PCR, ayant recours étant donné le volume d’échantillons
à traiter, à l’automatisation. Durant cette période,
les locaux ont été aménagés pour la production
et l’analyse d’un grand nombre de mutants. La phase pilote conduite
de mars à décembre 2000 a abouti à la production
de 7100 lignées dont 4500 (60%) ont été retenues
sur la base de l’amplification d’une région flanquante
unique qui sera par la suite séquençée.
Les transformations ont été réalisées
avec des vecteurs ADN-T évolutifs ayant permis notamment de tester
un nouveau promoteur pour diriger l’expression du gène sélectionnable
et l’efficacité de l’enhancer trapping basée sur
le système rapporteur gusA. Afin d’examiner l’efficacité
du système chez le riz, la fréquence de détection
d’activité spécifique GUS dans les organes végétatifs
et reproducteurs a été conduite chez environ 2300 transformants
primaires. A partir de janvier 2001, ont été lancées
quatre expériences de transformation comprenant chacune environ
1300 cals co-cultivés p4978, et destinées à produire
5 à 6000 transformants primaires chacune. Une efficacité
de transformation moyenne de cinq transformants par cal co-cultivé
était visée sur la base des de la production pilote. Une
serre S2 (380 m2 + 140 m2 de halle technique) a été mise
en service pour accueillir la population de transformants primaires. A
l’issue de la Phase 1 du projet, 25 000 transformants primaires ont
été produits et le séquençage de plus de 8,000
régions flanquantes a permis l’obtention de plus de 4000 séquences
génomiques qui ont pu être positionnées sur le génome.
Une base de données regroupant les observations phénotypiques
et les informations de séquence est en cours de développement.
Publications / Valorisation
• Delseny et al (2001) Plant Physiol Biochem 39,
323-334
• Delseny M, Pelletier G (2002) C R Acad Sci
• Delseny M et al (2002) Plant Cell 14, 537-545
• Sallaud C, Meynard D, Van Boxtel J, Gay C, Bes M, Brizard JP, Ortega
D, Raynal M, Portefaix M, Ouwerkerk P, Rueb S, Delseny M, Guiderdoni E
(2003) Highly efficient production and characterization of T-DNA plants
for rice (Oryza sativa L.) functional genomics Theor Appl Genet, sous
presse
Développement
des techniques de BAC FISH et de peignage d’ADN pour faciliter la
cartographie physique et en particulier accélérer les projets
de clonage positionnel
Partenaire
CIRAD, TA40/03, 34 Montpellier
Coordinatrice du projet
Angélique D’Hont (d'hont@cirad.fr)
Contexte et objectifs du projet
Ce projet consiste à fournir à la communauté
scientifique française une plate-forme pour la cytogénétique
moléculaire végétale afin de faciliter la cartographie
physique et en particulier les projets de séquençage et
de clonage positionnel. En effet, la cartographie physique du génome
des plantes a bénéficié de différentes techniques
de clonage et de manipulation de grands fragments d’ADN (YAC, BAC,
…). Néanmoins, de nombreux projets de séquençage
ou de clonage positionnel sont aux prises de difficultés d’ordonnancement
local. Les techniques de cytogénétique moléculaire
récentes ouvrent de nouvelles perspectives. Ainsi, l’hybridation
de clones BAC sur chromosomes (BAC-FISH) en métaphase permet leur
assignation à un chromosome particulier, contournant ainsi le besoin
de population de cartographie et les étapes laborieuses de cartographie
génétique.
A un niveau de résolution plus fin, la mise au point de l’hybridation
in situ sur chromosomes au stade pachytène permet l’ordonnancement
de BACs le long d’un chromosome avec une résolution de 50
kbases. Ceci permet d’accélérer la marche chromosomique
en réduisant les étapes de cartographie génétique
particulièrement laborieuses chez les espèces à faible
taux de polymorphisme et les polyploïdes. La technique de peignage
d'ADN représente un nouveau bond dans la résolution, puisqu’elle
permet d’analyser des fragments de 500 à 2000 kb avec une
résolution de 1kb. Cette dernière technique aide à
résoudre les problèmes d’ordonnancement local dus à
la présence de séquences répétées qui
souvent empêchent toute progression vers les gènes cibles
ou l’assemblage de séquences.
Présentation des résultats
Au cours de ce projet, une formation aux techniques BAC-FISH
et fiber FISH a été réalisée dans le laboratoire
de J. Jiang à l’université de Madison, USA. D’autre
part, la technique de BAC-FISH a été transférée
au laboratoire sur le sorgho.
Conclusions et perspectives
La technique de BAC-FISH est en cours de transfert sur
d’autres espèces : riz, bananier, café et est donc
accessible aux équipes qui le souhaitent. Le transfert de la technique
Fiber- FISH est en cours sur le riz.
Marquage
de QTL chez le sorgho en vue du clonage de gènes d'intérêt
générique. Développement de ressources moléculaires
SSR et BAC
Partenaire
CIRAD, TA 40/03, 34398 Montpellier
Coordinateur du projet
Jean-Christophe Glaszmann (glaszmann@cirad.fr)
Contexte et objectifs du projet
Le sorgho est une céréale majeure en Afrique
et en Inde, dont la culture en France progresse en
régions méridionales comme élément de l'alimentation
du bétail. C'est par ailleurs un voisin proche du maïs, autogame
et au génome quatre fois plus petit, qui peut servir de modèle
pour certains aspects de l'analyse génétique. Le projet
a deux composantes : le développement de microsatellites pour la
cartographie génétique et la constitution d'une banque BAC
pour la cartographie fine et le clonage positionnel de gènes d'intérêt
agronomique. Le modèle mis en avant initialement était la
résistance aux punaises des panicules. Le constat d'une héritabilité
insuffisante de ce caractère (tel que mesuré) dans une descendance
non fixée a conduit à cibler les objectifs vers les composantes
de la valeur fourragère, teneur en sucre et en fibre des tiges,
étudiées sur une descendance de 194 lignées recombinantes
issues du croisement Sariaso 10 x 249. Plus récemment, il a été
décidé d'explorer une démarche spécifique
pour tester la valeur du sorgho comme homologue autogame du maïs
pour des études d'associations.
Méthodologie
Pour le développement des marqueurs microsatellites
(séquences génomiques particulières, servant de marqueurs
de position pour cartographier un génome), une banque enrichie
en microsatellites (à motif répété GT) a été
produite après restriction par l'enzyme de restriction SAU3A en
suivant la méthode d'enrichissement par capture. La construction
de la banque BAC a été réalisée selon un protocole
proche de celui utilisé à l'Université de Clemson
(E-U) pour la construction d’une banque BAC chez le riz. Diverses
modifications (filtration pour améliorer la qualité de l'ADN
à cloner, choix du vecteur...) ont permis d'adapter le protocole
à notre variété de sorgho Sariaso 10, parent de la
population de lignées recombinantes. Pour l'étude exploratoire
du déséquilibre de liaison, en vue de conduire des études
d'association caractères/marqueurs, une région particulière
distale du chromosome D du sorgho a été choisie. Des banques
spécifiques enrichies en marqueurs microsatellites ont été
produites dans cette région à partir des 6 contigs de BAC
identifiés.
Présentation des résultats
Quatre cents clones contenant un microsatellite ont été
séquencés et les amorces définies pour 173 de ces
séquences. Quarante microsatellites ont permis de génotyper
les 194 lignées recombinantes. La carte
génétique a pu être construite avec un ensemble de
98 marqueurs (dont 49 locus RFLP ainsi que 19 microsatellites développés
par d'autres équipes). Elle couvre une distance de 1434 cM et devrait
être densifiée dans certaines zones afin de permettre une
meilleure détection de QTLs.
La banque BAC produite comporte 45 000 clones, de taille moyenne de 99
kb. La réalisation de huit jeux de membranes "haute densité"
a permis l'évaluation de la contamination cytoplasmique de la banque
(1,2% ) et la caractérisation partielle de cette banque (5 équivalent
– génome).
Les huit marqueurs microsatellites, obtenus par la construction de banques
spécifiques, ainsi que les RFLP déjà disponibles,
ont permis d'étudier la distribution du déséquilibre
de liaison et d'examiner le comportement des marqueurs microsatellites
par rapport aux RFLP. Certains microsatellites ont montré des associations
fortes par rapport aux locus RFLP proches ; ce sont ceux révélant
plusieurs sous-ensemble d'allèles de tailles nettement différentes
(distribution multimodale). Ce type de marqueurs microsatellites s'est
révélé très intéressant pour conduire
des études de DL (déséquilibre de liaison). Les résultats
ont montré que le DL pouvait s'étendre sur des distances
de l'ordre du centiMorgan et couvrant jusqu'à 250 kb.
Conclusions et perspectives
Après densification de la carte génétique
sorgho et utilisation de gènes candidats intervenant dans la voie
de biosynthèse des lignines déjà cartographiés
par les équipes GÉNOPLANTE maïs, une étude de
la synténie maïs / sorgho pour la valeur fourragère
pourra être bénéfique pour les deux espèces.
L'application des études d'association au modèle sorgho
pourra apporter une résolution située entre celle des études
QTL et celle des études d'association chez le maïs ; la colinéarité
de génome entre les deux espèces permettra un pontage pour
une transposition réciproque des résultats et des validations
croisées. Les possibilités d'étude comparative mettant
cette voie à profit sont à l'étude.
Une projet a été soumis dans le cadre GÉNOPLANTE
– GABI, proposant des études d'associations caractères/marqueurs
et l'analyse comparative du déséquilibre de liaison chez
plusieurs céréales (orge, blé, maïs, sorgho
et riz). Le polymorphisme existant dans plusieurs gènes candidats
sera étudié (en développant des SNP) et mis en relation
avec la variation phénotypique. Plusieurs caractères d'intérêt
ont été ciblés, en particulier, la qualité
du grain (teneur en amylose, en protéines,..), la sensibilité
à la photopériode et la précocité.
Publications / Valorisation
• Publications : prévues fin 2003 concernant
la mise à jour de la carte génétique et l'identification
des zones génomiques impliquées dans la valeur fourragère
• Valorisation : mise à disposition des partenaires de GÉNOPLANTE
des ressources créées
Intégration
et visualisation des données de cartographie et de synténie
des espèces végétales
Partenaires du projet
• GÉNOPLANTE-Info, 91 Evry
• RhoBio, Evry
• INRA-CNRS-UPS, Station de génétique végétale,
Gifsur-
Yvette
• Biogemma, Clermont-Ferrand
• INRA de Versailles et Rennes
• INRA-CNRS, Unité de recherche en génomique
végétale, 91Evry
• CIRAD
• IRD
Coordinateurs du projet
Emmanuel Barillot/Aymeric Duclert
Contexte et objectifs du projet
La cartographie constitue un outil majeur d’élucidation
du déterminisme génétique et est très largement
utilisée dans le cadre des programmes Génoplante sous toutes
ses formes : cartographie génétique, physique, cytogénétique
et cartographie comparée entre espèces modèles et
d'intérêt économique proches dans la phylogénie.
Le projet aura pour objectif de créer un modèle objet de
représentation des connaissances de cartographie et de synténie,
puis
d'implémenter une base de données correspondante. Des nomenclatures
de loci seront mises en place, puis les données de Génoplante
et celles disponibles dans le public qui sont pertinentes pour la cartographie
seront intégrées dans la base. Une interface de visualisation
des données de cartographie et de synténie qui intégrera
aussi les données d'annotation fonctionnelle sera mise en place
au-dessus de la base.
Méthodologie
Le projet, modélisé sous UML, utilise une
base de données relationnelle (sous Oracle), une couche objet pour
représenter les données de cartographie, des outils de visualisation
textuelle accessibles via le web et enfin des outils de visualisation
graphique utilisant les technologies java avec architecture 3 couches.
Présentation des résultats
Une base de données pour le stockage des données
de marqueurs, de QTL et de populations a été crée.
Le modèle de cette base est capable de stocker une grande variété
de types de données de cartographie. Une interface web textuelle
de première génération donnant accès aux données
de la base a été mise à disposition de la communauté
Génoplante. Cette interface, adaptée d'une interface pré-existante,
sera remplacée dans le futur par une interface plus complète
basée sur les technologies JSP/Servlet. En outre, le prototype
d'une interface de choix, puis de visualisation des cartes développé
en java est actuellement disponible. Ce prototype sera enrichi afin de
présenter de manière ergonomique la totalité de l'information
disponible sur une région du génome et sur les régions
équivalentes dans d'autres espèces.
Conclusions et perspectives
Ce projet va permettre au biologiste d'obtenir facilement
une vue globale sur une région du génome afin de rechercher
et sélectionner les gènes candidats les plus prometteurs
en liaison avec un trait phénotypique donné. Il permettra
donc d'accélérer considérablement la recherche des
gènes critiques pour l'amélioration des variétés
végétales.
Obtention
d’EST de blé
Partenaires
-
INRA, Biochimie et biologie moléculaire des
céréales, 34 Montpellier
-
RhoBio, 91 Evry
-
Biogemma, 63 Aubière
INRA, 63 Clermont-Ferrand
Coordinateurs du projet
Philippe Joudrier (joudrier@ensam.inra.fr)
Xavier Sarda
Contexte et objectifs du projet
La phase 1 de ce projet GÉNOPLANTE avait pour
objectif de générer 100 000 séquences transcrites
de gènes (EST ; Expressed Sequenced Tags) à partir de l’espèce
blé. Les efforts se sont concentrés sur l’obtention
de banques d’ADNc au cours du développement du grain de blé
(banques préparées tous les 50°C.jour après anthèse)
et de banques de feuilles ou de racines pour répondre à
la problématique de tolérance à la fumure azotée.
Méthodologie
• Préparation du matériel biologique
(Clermont- Ferrand). Mise en culture, en conditions contrôlées,
de la variété Récital et prélèvements
d’épis aux différents stades de développement
du grain.
• Préparation des banques d’ADNc (Montpellier) réalisées
à partir de chaque stade de développement.
• Normalisation des banques et préparation des clones d’ADNc
en vue de leur séquençage (RhoBio). Une technique de normalisation
post-clonage à haut débit a été développée
au cours de ce programme. La « soustraction virtuelle » consiste
à déposer 30 000 clones d’une banque sur filtre haute
densité puis à hybrider ces filtres avec 384 clones de cette
banque préalablement séquencés. Ainsi tous les clones
donnant un signal d’hybridation sur le filtre correspondent à
des clones déjà séquencés et ne sont pas sélectionnés
pour la suite de la campagne de séquençage. Il est possible
de réaliser plusieurs cycles de « séquençagehybridation-
sélection » jusqu’à obtenir le niveau de redondance
désiré. La technique a également été
utilisée pour réduire la redondance d’une banque à
l’autre.
Présentation des résultats
• Dès 1999, 3700 clones issus d’une
banque de racines de blé dur soumises à un stress hydrique
ont été séquencés et envoyés au consortium
ITEC, ce qui a permis à Génoplante de devenir membre du
consortium.
• Grain : neuf banques d’ADNc standards normalisées par
soustraction virtuelle et deux banques soustractives ont été
construites. 67500 séquences faiblement redondantes ont été
obtenues à partir des clones issus de ces banques. Le niveaux de
redondance entre ces différentes banques est faible grâce
aux hybridations croisées entre banques. (- de 20 %).
• Carence azotée : quatre banques ont été construites
à partir de feuilles et des racines soumises ou non à la
carence azotée. Après soustraction virtuelle 22 000 séquences
faiblement redondantes ont été obtenues. • Environ
10 000 séquences supplémentaires ont été obtenues
à partir de banques diverses (Feuille F1, Glumes infectées
par Fusarium). Conclusions et perspectives Le projet a permis de générer
une collection de séquences unique et une ressource biologique
importante. Un contigage de ces séquences avec celles contenues
dans les bases de données publiques a permis de définir
43 000 TUGS. Les séquences et les clones pourront être utilisés
pour la cartographie, la recherche de gènes et ADNc pleines longueurs,
la génomique fonctionnelle, la transgenèse. La collection
de clones est utilisée dans le cadre de Génoplante II pour
la construction d’une puce à ADN de plus de 20000 gènes
Publications / Valorisation
• Publications : aucune
• Valorisation : obtention de matériels biologiques à
disposition des partenaires du programme GÉNOPLANTE (400 000 clones
ADNc, 100 000 EST). Il est prévu de mettre dans les bases de données
publiques le sséquences des EST à partir de juillet 2003.
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