Diversité génétique
Stratégie de conservation in
situ des ressources génétiques en Guinée
Un projet d’analyse de la diversité génétique
des riz cultivés en Guinée est en cours en collaboration
avec l’IRAG. L’ensemble des analyses de diversité est réalisé
à l’aide de marqueurs microsatellites. Les résultats préliminaires
font état d’une structuration de type multilignée des variétés
locales. Cette structure pourrait être liée soit à
des mélanges volontaires ou involontaires de semences soit à
des mutations répétées au niveau des locus microsatellites.
Constitution d’une Core collection pour les riz européens
Dans le cadre d’un projet d’inventaire et de caractérisation
(morphologiques, agronomiques, technologiques et moléculaires)
des ressources génétiques du riz disponibles au sein de
l'Union européenne, 16 marqueurs microsatellites ont été
utilisés pour décrire quelque 450 accessions. Une core
collection de 120 variétés a été constituée
(Clément et al., 2001). Une base de données portant sur 50
critères phénotypiques et 16 marqueurs génotypiques
est mise à disposition des sélectionneurs européens,
sous forme d’un cédérom et bientôt en ligne sur le
site web du Cirad.
Diversité génétique des variétés
locales de riz à Madagascar
Dans le cadre d’une collaboration avec l’université
d’Antananarivo, la diversité génétique des variétés
locales de riz à Madagascar a été analysée
à l’aide de marqueurs microsatellites. L’existence de types variétaux
nouveaux ne correspondant pas aux groupes classiquement identifiés
au sein d’O. sativa est confirmée. Il s’agit de variétés
de culture inondée provenant majoritairement de la zone des hauts
plateaux.
Séquençage allélique
Le séquençage de clones BAC issus des quatre
banques a été entrepris autour du marqueur RG869 sur le
chromosome 12, dans une zone riche en gènes de résistance
(gène majeur de résistance à la pyriculariose et
gène de résistance partielle au virus de la panachure jaune).
Les séquences disponibles couvrent entre 50 et 120 kb. L'évaluation
qualitative et quantitative du polymorphisme est en cours.
Contrôle génétique
de caractères agronomiques
Résistance partielle au virus de la panachure
jaune du riz (RYMV).
La détection de QTL de résistance partielle
au RYMV a été réalisée dans le cadre d’une
collaboration IRD / Cirad / IER (Mali). Un grand nombre de QTL ont été
identifiés dans une population d’haploïdes doublés
issue du croisement entre un géniteur japonica résistant,
Azucena, et un géniteur indica sensible, IR64 (Albar et al., 1998;
Pressoir et al., 1998 ; Ahmadi et al., 2001). L’analyse des interactions
entre QTL a conclu au rôle déterminant d’une épistasie
complémentaire entre deux QTL. Cette hypothèse a été
par la suite vérifiée expérimentalement après
l’introgression simultanée, assistée par marqueurs moléculaires,
de deux QTL de résistance au RYMV d’Azucena, vers IR64. L’efficacité
des QTL introgressés dans un fond génétique indica
a été vérifiée. Un marqueur microsatellite
pour la sélection assistée par marqueur pour le QTL12
en routine a été développé. De même
des lignées isogéniques servant à l’analyse fine
des mécanismes de résistance sont créées.
Résistance partielle à la pyriculariose
Un projet qui vise, simultanément, à détecter
des QTL de la variété Moroberekan et à les introgresser
dans la variété pluviale d'Inde de l’Est, Vandana, est en
cours. Deux populations BC2F3 et BC3F3 dérivées de ce croisement,
de respectivement 85 et 95 individus, ont été génotypées
au Cirad avec des marqueurs microsatellites, et phénotypées
en Inde et aux Philippines. La construction des cartes et l'analyse de
QTL sont en cours.
Résistance à la sécheresse
L'adaptation du riz aux contraintes abiotiques a fait
l'objet de nombreux travaux dans le cadre d'une collaboration avec l'Irri
aux Philippines (Kirk et al., 1998; Price et Courtois, 1999; Courtois et al., 2000; Zheng et al., 2000; Lafitte et Courtois, 2002; Lafitte et al.,
2002). Un projet visant à simultanément détecter
des QTL de résistance à la sécheresse et les introgresser
dans du matériel d'intérêt en utilisant la méthode
du back-cross avancé est en cours de finition. Une collaboration
avec l’université de Cornell (USA) sur le thème de la discrimination
isotopique du carbone est en cours de montage (année sabbatique
D. This 2003-2004)
Cartographie parallèle avec le blé
Un exercice de cartographie comparée ciblée
entre riz et blé a permis d'épauler l'équipe de l'Inra
de Clermont-Ferrand dans sa cartographie fine autour d'un gène
de "crossability" chez le blé tendre (chromosome 5B) (Lamoureux
et al., 2002).
Transformation génétique
Amélioration des méthodologies de transformation
La possibilité de transformer le riz par biolistique
avec des cassettes de gènes à la place des plasmides entiers
a été démontrée (Breitler et al. 2002).
La transformation à l’aide d’Agrobacterium
tumefaciens constitue cependant la méthode la plus efficace
aujourd’hui (cf figure ci-contre) (Sallaud et al., sous presse).
Le repositionnement par transposon et ségrégation
indépendante d’un transgène du site d’intégration
de l’ADN-T a pu être vérifié (Cotsaftis et al. , 2002).
Un vecteur à double ADN-T permettant une haute
fréquence de co-transformation et la ségrégation
indépendante du gène de sélection et du gène
d’intérêt a été construit et transféré
dans trois variétés de riz. La ségrégation
independante a été démontrée par analyse Southern.
Trois vecteurs permettant d’évaluer la fréquence
de recombinaison homologue chez le riz par disruption, remplacement d’allèle,
ou reconstitution d’une cible artificielle (transgène gfp) ont
été construits et transférés dans le riz.
Parallèlement, un gène codant pour la protéine de
recombinaison OsRad50 destinée à être sous exprimée
pour augmenter cette fréquence chez le riz a été
cloné.
Résistance aux insectes
En partenariat avec l’Irta (Espagne), la possibilité
d’une protection complète et comparable à celle apportée
par l’expression constitutive (promoteur Ubi1 : Breitler et al.,
2000) ou inductible par blessure (promoteur mpi : Breitler et al.,
2001) du gène de Bt cry1B déjà observée en
serre a été constatée dans un essai au champ.
La protection obtenue par une expression d’un gène
cry1B contrôlé par le promoteur stimulé par la blessure
hrgp du maïs a été démontrée (Breitler
et al. , sous presse).
Des événements de transformation exprimant
le gène cry1Aa ou une fusion entre les séquences codantes
des gènes cry1B et cry1Aa ont été identifiés.
La combinaison des gènes cry1B et cry1Aa est également en
cours par croisement.
En partenariat avec le Csic de Barcelone, l’activité
in planta d’un gène d’inhibiteur de protéases à sérine
du maïs, Maize Protease Inhibitor, au niveau de la croissance larvaire
et de l’inhibition des protéases à chemotrypsine des larves
de foreur des tiges (Ujaldon et al. en préparation) a été
démontrée.
Tolérance Salinité/Sécheresse
Plus de 450 plantes ont été produites et
caractérisées sur le plan moléculaire, ayant intégré
des gènes intervenant dans le métabolisme de la proline
(P5CS sensible et insensible à la rétroinhibition et OAT
d’ Arabidopsis thaliana) ou du tréhalose (Tps1 de la levure), et
dans l’homéostasie de ions (HAL1 de la levure, antiporteur Na+/H+
de la membrane vacuolaire AtNHX1 d’ Arabidopsis thaliana) placés
sous le contrôle du promoteur constitutif e35S. Pour le gène
TPS1 dont l’expression constitutive a des effets adverses sur la régénération,
on a également utilisé un promoteur induit par la déshydratation
du gène TAS14 de la tomate. Enfin, la possibilité d’introduction
d’un crible salin au niveau des lignées cellulaires transformées
en utilisant 200mM NaCl a été démontrée.
Génomique fonctionnelle
Analyse fonctionnelle de promoteurs
La dissection fonctionnelle de divers promoteurs a été
réalisée : activité spécifique du grain
de blé tendre avec purob (Digeon et al. 1999) et thioredoxine h
(Ihorai et al. en préparation), activité spécifique
des épidermes et inductible par attaque fongique du riz avec ltp1
(Guiderdoni et al. 2002), activité préférentielle
dans les racines chez CgMT1 (Franche et al. 2003), et activité inductible
par blessure avec mpi et hrgp du maïs (Breitler et al. en préparation).
Mutagenèse par Transposon Ac/Ds
Ont été réalisées l’identification
de lignées actives ayant intégré un système
à double composant AcTpase/Ds (Greco et al. 2001a et b), la caractérisation
moléculaire de lignées actives de partenaires du projet
et la démonstration de la possibilité de mobiliser en trans
un élément Ds par croisement avec une lignée exprimant
une source de transposase.
Projet Génoplante " Analyse fonctionnelle
du génome du riz "
25,000 lignées d’insertion contenant un ADN-T
enhancer trap gusA ont été produites avec une efficacité
de transformation moyenne de 5 événements de transformation
par cal co-cultivé (500%)
 |
Des tests histochimiques ont été
conduits sur les organes végétatifs et reproducteurs
de plus de 2,200 plantes : détection d’une activité
GUS dans 27%, 7% et 3% dans les feuilles, racines et ovaires/étamines
respectivement.
Photo : Ovaire de riz exprimant le gène GUS (E. Guiderdoni) |
L’activité transpositionnelle du rétrotransposon
endogène Tos17 parmi les régénérants de diverses
variétés de riz montrant une influence des copies présentes
et de la variété a été étudiée.
L’amplification des régions flanquantes dans les
plantes ADN-T des nouveaux inserts Tos17 a été optimisée
(1-8 , 3,2 en moyenne dans 95% des plantes).
Les régions flanquantes de plus de 20,000 plantes
ont été amplifiées et le séquençage
de 7,500 régions flanquantes réussi (séquence
géomique informative de plus de 30 pb); 75 % des Flanking Sequence
Tags sont assignées à un chromosome du riz, ce qui correspond
au statut du séquençage avec distribution conforme à
la partie séquencée de chaque chromosome. Les résultats
montrent que l’ADN-T s’intègre rarement dans les régions
répétées et préfréentiellement dans
les régions richées en gènes (régions géniques
et intergéniques) et qu’entre 5 et 10% des gènes du riz
sont potentiellement étiquetés par ces 7,500 FST
Génomique de la tolérance aux stress abiotiques
Le premier projet engagé est l’identification
de gènes différentiellement exprimés lors du stress
salin chez le riz. Les résultats obtenus sont : définition
des paramètres de stress (durée, sévérité..) ;
suivi de paramètres biochimiques et physiologiques chez trois variétés
de riz ayant des réponses contrastées vis à vis du
stress ; identification des stades pertinents pour le prélèvement
des tissus pour l’extraction d’ARNm et la réalisation d’enrichissement
/ soustraction par "Suppression Subtractive Hybridization".
Le deuxième projet consiste à identifier
et caractériser des mutants de riz affectés dans des gènes
jouant un rôle clé dans la réponse au déficit
hydrique (gènes du métabolisme carboné, gènes
impliqués dans le déterminisme de l’architecture et du développement
végétatif, gènes induits sous stress susceptibles
d’apporter une tolérance en conditions de déficit hydrique…).
A l’heure actuelle, seuls certains mutants du métabolisme carboné
ont été identifiés par homologie avec les FST des
mutants de riz du projet Génoplante Os GrF.
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